小RNA（small RNA）是一类长度约16-200 nt的非编码RNA，主要包括微小RNA（ miRNA）、小干扰RNA（ siRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、小胞质RNA （scRNA）等多种类型。小RNA不编码蛋白质，但它们发挥着重要的调控功能，尤其是在基因转录后调控过程中起到关键作用。2006年诺贝尔生理学或医学奖授予小RNA干扰机制的发现者，2024年，该奖项再次聚焦小RNA领域，表彰miRNA发现及其在转录后基因调控中的关键作用。

高通量测序技术是组学水平上发现、鉴定并解析小RNA的关键手段。现有小RNA测序技术通过两步连接或聚合反应，在多类型小RNA分子的两个末端分别加上一段通用序列（5’接头和3’接头），从而形成测序文库，后续可以统一扩增和高通量测序。在构建测序文库过程中，不同小RNA分子的反应效率差异较大，低丰度分子更是难以检测。此外，还会产生两种接头的异源二聚体副产物（接头二聚体），造成测序数据有效利用率下降30%-50%，显著降低小RNA序列覆盖率和定量精度。因此，提高建库反应效率并减少接头二聚体，是小RNA测序领域的重大挑战和迫切需求。

近日，西安交通大学赵永席教授团队构建了一种基于随机接头池二聚体阻断与切除的小RNA测序技术(randomized Adapter pool dimer Blocking and Cleavage in smRNA-seq, ABC-seq)，既能利用随机接头池提高连接效率、降低序列偏差，又能抑制并切断随机接头池二聚体副产物。研究人员首先分析了接头二聚体来源于单链连接酶对两种接头的非特异连接，将使用过的接头变成双链结构则有望抑制该反应。同时，他们还分析了随机接头池二聚体的序列结构，其中段是…NNN…随机序列，两端都是已知序列；为了特异切除该二聚体，需要识别一端已知序列并跨过中段随机序列，切断另一端的已知序列。基于此，研究人员首先设计了含限制性酶识别位点或切割位点的随机接头池，3'接头连接后，通过核酸结构识别引导的聚合反应，将剩余3'接头转化为双链以阻断其与5'接头形成二聚体；5'接头连接后，再通过核酸结构识别的酶切反应，特异性切除已生成的接头二聚体。该方法从上游的“抑制生成”和下游的“切除生成物”两个层面出发，最大程度降低接头二聚体在测序文库中的占比，从而提升组学水平小RNA检测性能（图1）。

图1. ABC-seq技术原理示意图。

为了论证该技术的普适性和实用性，研究人员分别检测了肿瘤细胞系、心肌细胞系和临床血液细胞中的小RNA组。相比于现有小RNA测序技术，ABC-seq在心肌肥大细胞中检测到更全面的小RNA种类，包括miRNA、scRNA和snoRNA，其中miRNA检出量提升9.4%（图2）。在非小细胞肺癌患者外周血CD4+ T细胞中，该技术鉴定出172种药物治疗响应的miRNA。研究人员还揭示了上述miRNA调控免疫功能的潜在机制。该研究成果已申请国家发明专利（已公布）。

图2. ABC-seq与现有方法的比较分析

(a) ABC-seq和A-seq之间由UMI数量量化的RNA水平的关联性；(b) ABC-seq与现有方法之间的Spearman相关性分析；(c) ABC-seq与现有方法在心肌肥大细胞中检测的smRNA类型分布；(d) ABC-seq与现有方法检测到的rRNA、miRNA、snRNA和snoRNA含量比较（n=3）；(e) 在100 ng小RNA输入下检测心肌肥大细胞miRNA的韦恩图及柱状图，代表各方法检出miRNA的数量；(f) ABC-seq检测心肌肥大细胞miRNA的韦恩图及柱状图（n=3）

近日，该研究成果以《ABC-seq利用连续核酸结构区分的酶识别拓展小RNA组学剖析》（ABC-seq Expands Small RNAs Profiling with Successive Nucleic Acid Structure-differentiated Enzymatic Recognition）为题在国际权威期刊《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）上在线发表。西安交大生命学院生物医学信息工程教育部重点实验室为该论文第一作者单位和通讯作者单位，前沿科学技术研究院为共同通讯单位，赵永席教授和陈锋教授为共同通讯作者，博士研究生余骅航为第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、陕西省自然科学基金、西安交大青年拔尖人才计划多个项目的共同资助，实验测试得到西安交大分析测试中心的大力支持。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202423208

赵永席教授团队主页：

http://gr.xjtu.edu.cn/web/yxzhao