上个世纪，英国剑桥的医学中心分子生物学实验室(MRC-LMB) Sydney Brenner团队耗时14年，在1986年首次解析出秀丽隐杆线虫(C. elegans)的神经连接组，涉及302个神经元和7600个突触，并因此获得2002年诺贝尔生理学及医学奖。今年3月，LMB的Marta Zlatic团队耗时12年，在Science上发布了迄今为止最完整的果蝇幼虫全脑神经元连接组图谱，涉及3016个神经元和神经元之间的54.8万个突触连接，这已是有史以来所能完成的最复杂的动物大脑图谱。
2023年9月28日，西安交通大学电信学部软件学院联合剑桥LMB实验室，在《自然方法》(Nature Methods)以长文形式发表文章《D-LMBmap: 基于深度学习的全脑神经环路量化解析方法》（D-LMBmap: a fully automated deep-learning pipeline for whole-brain profiling of neural circuitry），借助深度学习与图像处理技术，开发了介观尺度下小鼠全脑神经环路的量化解析方法，将神经环路与连接组的研究从几百到几万神经元的线虫、果蝇更易于进一步扩展至上亿神经元的小鼠中。
随着近些年来显微成像、神经元示踪以及组织透明化技术的发展，小鼠介观全脑高通量的成像数据飞速积累。然而由于小鼠大脑神经元分布密集且极度复杂、脑成像方式多样等因素，下游的计算与分析任务正成为解析神经连接组学的主要技术瓶颈，目前仍缺少一套能完整实现全脑神经环路量解析的计算方法与工具。为此，软件学院祝继华教授团队青年教师李钟毓联合LMB实验室任婧团队，开发了一套基于深度学习的算法和工具D-LMBmap(deep-learning pipeline for mouse brain mesoscale automatic profiling)，实现了从全脑神经元的自动分割及环路重建、跨模态的脑图像风格转换及脑区分割到三维全脑配准及神经环路投射的整个流程。
D-LMBmap的主要工作：A. LSFM全脑成像流程，包括自身荧光(488nm)和染色特异性(647nm)两个通道；B.全脑神经元分割与环路重建；C.脑图像风格迁移，将LSFM脑图像迁移到Allen图谱的风格；D.脑区分割；E.全脑的三维配准和环路在各脑区的投射；F. D-LMBmap的软件界面及量化解析结果.
研究团队首次开发了一套神经元的自动标注方法，通过筛选相对干净的神经元前景和背景立方体区域，结合多种数据增强技术，以此训练面向神经元分割的三维深度神经网络模型，极大避免了繁琐且耗时的人工标注过程。该方法可在数个小时内快速实现全脑数据上各种类型神经元(5-羟色胺、多巴胺、GABA等)的分割与全脑环路重建。该方法同样适用于由不同示踪方式标记的神经元，无论稀疏或密集都可以被准确分割。
考虑到不同成像方式下的脑图像存在模态差异，D-LMBmap将图像的风格迁移技术扩展到了脑图像中，该方法可将光片显微镜成像(LSFM)、核磁共振成像(MRI)等模态的脑图像与目前广泛使用的Allen脑图谱(Allen CCFv3)图像进行风格统一，从而缓解了脑图像的跨模态问题，并以此开发了半监督多视角的脑区分割方法，在无需或仅需少量脑区标注的前提下，即可实现大脑中主要脑区的精确分割(如大脑皮层，纹状体，小脑皮层，脑干等)。
这项工作还开发了一种基于多重约束的多尺度三维全脑配准方法，将以上获取的具有Allen图谱风格的实验脑以及自动分割的主要脑区作为配准网络中的约束，设计了一种由低分辨率到高分辨率级联的配准网络模型。该方法可以在几分钟内生成准确性和鲁棒性较高的跨模态配准结果(例如从LSFM脑配准到Allen CCFv3图谱)，结合全脑神经环路的重建结果，可精确地量化数百个大脑区域的神经元密度。
在以上所设计算法的基础上，团队进一步开发了一个用户友好且高效的软件工具，并为其配置了面向LSFM脑图像的深度神经网络模型，用户可以使用其进行三维脑图像的预处理、神经元自动分割、脑图像风格迁移、脑区分割、全脑配准以及连接组在各脑区的投射。D-LMBmap同时提供了软件的详细使用教程，无需计算机编程基础即可直接上手使用。
5-羟色胺神经元的全脑分割结果
基于以上方法和所开发的软件工具，团队人员定量的解析出了5-羟色胺、多巴胺、GABA以及小脑中央核团在成年小鼠全脑的神经环路，给出了这些类型的神经元在数百个脑区的投射分布情况。这其中也包括了首个dorsal raphe 5-羟色胺神经系统全脑投射的三维图谱。该项工作神经科学研究提供了一个强大的计算分析工具，使得研究人员更好地理解大脑神经环路的结构和功能，有助于推动脑连接图谱、神经疾病机理等问题的进一步研究。作者们已将全部程序开放共享，并配有指导录像(https://github.com/lmbneuron/D-LMBmap)。
软件学院祝继华教授团队青年教师李钟毓为论文第一作者，软件学院商增谊硕士、刘婧怡硕士、甄昊天硕士、朱恩涛硕士生为共同第一作者，英国剑桥分子生物学实验室(MRC-LMB)任婧研究员为论文通讯作者。LMB实验室位于英国剑桥，是首次破译DNA双螺旋结构的实验室，迄今为止LMB的科学家们共获得过12次诺贝尔奖，有“诺奖工厂”之称。李钟毓曾于2021年10月至2022年10月受邀在此实验室担任研究员并开展合作研究。
论文链接: https://www.nature.com/articles/s41592-023-01998-6
