RNA分子的种类与亚细胞空间分布多样，同时分析单细胞内多种RNA对深入研究细胞异质性与疾病机制至关重要。荧光原位杂交成像技术可在单细胞水平观测RNA的类型、丰度与空间分布。然而，由于不同荧光基团之间存在光谱重叠，常规荧光显微成像一般只能同时检出4种目标分子。此外，RNA原位成像通常需要联合原位核酸扩增，以提高信号强度达到单分子检出水平。然而，此类方法大多需要外加扩增引物，其非特异性吸附与脱靶杂交容易导致假阳性干扰，且在多目标成像中更为严重。

针对上述问题，西安交通大学生命学院生命分析化学与仪器研究所赵永席教授团队提出核酸扩增组装编码荧光成像新方法，发展目标RNA自引发原位滚环扩增策略并构建了分级DNA支链组装编码荧光纳米梯，消除了外加扩增引物导致的非特异干扰，通过DNA支链编码同种荧光的不同强度信号，同时实现了单细胞内多种RNA的高特异性成像分析。该研究思路的设计核心是环状核酶探针与可编程的DNA支链条码。首先，环状核酶探针通过互补杂交结合目标RNA，并利用核酶的催化切割功能特异切断目标RNA，生成具有3’-OH末端的扩增引物，实现RNA自引发原位滚环扩增，消除非特异性扩增干扰。随后，该扩增产物可捕获DNA支链条码，并杂交组装不同种类与数目的荧光探针，联合荧光光谱与强度组合编码，显著提升信号种类，最终仅使用2种荧光检测通道即可实现9种RNA分子的同时成像。该方法已用于分析不同乳腺细胞系，揭示了癌症相关目标基因与癌症进程的潜在关联。理论上，该方法可进一步通过拓展荧光检测通道数目与支链条码编码区的杂交位点数目，数量级提升同时荧光成像的目标种类数目。

图1 （A）环状核酶探针和支链DNA条码探针的设计概念图；（B）分级DNA支链组装编码荧光纳米梯实现单细胞多种RNA同时成像

该研究工作以《分级DNA支链组装编码的荧光纳米梯用于单细胞RNA的成像分析》（Hierarchical DNA branch assembly-encoded fluorescent nanoladders for single-cell transcripts imaging）为题在国际权威期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research）上在线发表。西安交通大学生物医学信息工程教育部重点实验室为该论文的唯一单位，博士生曹晓文为第一作者，赵永席教授和陈锋教授为通讯作者。该研究得到国家自然科学基金杰出青年项目和陕西省自然科学基金的共同资助，实验测试得到西安交大分析测试中心的大力支持。

赵永席教授团队主要从事单细胞分析、高通量测序、微流控芯片领域的研究工作。近三年，该团队在单细胞核酸分析领域开展了系列原创工作，相关研究成果已发表在《化学研究评述》（Accounts of Chemical Research）、《自然-通讯》（Nature Communications）、《美国化学会志》（Journal of the American Chemical Society）、《德国应用化学》（Angewandte Chemie International Edition）、《核酸研究》（Nucleic Acids Research）等期刊。

论文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac1138

赵永席教授研究团队主页链接：http://gr.xjtu.edu.cn/web/yxzhao